PCR引物設計的目的是為了找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板DNA序列。引物的優(yōu)劣直接關系到PCR的特異性與成功與否。引物設計基礎如下：

1.引物長度：教科書要求15-30bp，常用為20bp左右。實際情況zui 好是18-24bp，以保證特異性，不是越長越好，太長的引物同樣會降低特異性，并且降低產(chǎn)量 。

2.引物擴增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。

3.引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC zui好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。5'端和中間序列要多GC，以增加穩(wěn)定性，避免3'端GC rich，zui后3個堿基不要有GC，或者zui后5個有3個不要是GC。

4.避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構，避免兩條引物間互補，特別是3’端的互補，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴增條帶。

5.引物3’端的堿基，特別是zui末及倒數(shù)第2個堿基，應嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。

6.引物中有或能加上合適的酶切位點， 被擴增的靶序列zui好有適宜的酶切位點， 這對酶切分析或分子克隆很有好處。

7.引物的特異性：引物應與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。

8.學會使用軟件：PP5，Oligo6，DNAstar，Vector NTI，primer3（這個在線設計zui好用）。

以上內(nèi)容，至少可以解決99%的引物設計問題。