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PCR 反應體系各個組份概述
日期：2025-06-16 18:23
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摘要：PCR 反應體系由反應緩沖液（10×PCR Buffer）、脫氧核苷三磷酸底物（dNTPmix）、 耐熱 DNA 聚合酶（Taq 酶）、寡聚核苷酸引物（Primer1，Primer2）、靶序列（DNA 模板） 五部分組成，各個組份都能影響 PCR 結果的好壞。
1、反應緩沖液：一般隨 Taq DNA 聚合酶供應。標準緩沖液含：50mM KCl，10mM Tris-HCl
（pH8.3 室溫），1.5mM MgCl2。Mg2+的濃度對反應的特異性及產量有著顯著影響。濃度過高，使反應特異性降低；濃度過低，使產物減少。在各種單核苷酸濃度為 200μM 時， Mg2+為 1.5mM 較合適。若樣品中含 EDTA 或其它螯合物，可適當增...
PCR 反應體系由反應緩沖液（10×PCR Buffer）、脫氧核苷三磷酸底物（dNTPmix）、 耐熱 DNA 聚合酶（Taq 酶）、寡聚核苷酸引物（Primer1，Primer2）、靶序列（DNA 模板） 五部分組成，各個組份都能影響 PCR 結果的好壞。
1、反應緩沖液：一般隨 Taq DNA 聚合酶供應。標準緩沖液含：50mM KCl，10mM Tris-HCl
（pH8.3 室溫），1.5mM MgCl2。Mg2+的濃度對反應的特異性及產量有著顯著影響。濃度過高，使反應特異性降低；濃度過低，使產物減少。在各種單核苷酸濃度為 200μM 時， Mg2+為 1.5mM 較合適。若樣品中含 EDTA 或其它螯合物，可適當增加 Mg2+的濃度。在高濃度 DNA 及 dNTP 條件下進行反應時，也必須相應調節(jié) Mg2+的濃度。一般 以 1.5-2mM（終濃度）較好。
2、dNTP ：高濃度 dNTP 易產生錯誤摻入，過高則可能不擴增；但濃度過低，將降低反應產物的產量。PCR 中常用終濃度為 50-400μM 的 dNTP。四種脫氧三磷酸核苷酸的濃度應相同，如果其中任何一種的濃度明顯不同于其它幾種時（偏高或偏低），就會誘發(fā)聚合酶的錯誤摻入作用，降低合成速度，過早終止延伸反應。此外，dNTP 能與 Mg2+結合，使游離的 Mg2+濃度降低。因此，dNTP 的濃度直接影響到反應中起重要作用的 Mg2+濃度。
3、Taq DNA 聚合酶酶：在 100μl 反應體系中，一般加入 2-4U 的酶量，足以達到每 min延伸 1000-4000 個核苷酸的摻入速度。酶量過多將導致產生非特異性產物。但是，不同的公司或不同批次的產品常有很大的差異，由于酶的濃度對 PCR 反應影響極大，因此應當作
預試驗或使用廠家推薦的濃度。當降低反應體積時（如 20μl 或 50μl），一般酶的用量仍不小于 2U，否則反應效率將降低。
4、 引物：引物是決定 PCR 結果的關鍵，引物設計在 PCR 反應中極為重要。
1、反應緩沖液：一般隨 Taq DNA 聚合酶供應。標準緩沖液含：50mM KCl，10mM Tris-HCl
（pH8.3 室溫），1.5mM MgCl2。Mg2+的濃度對反應的特異性及產量有著顯著影響。濃度過高，使反應特異性降低；濃度過低，使產物減少。在各種單核苷酸濃度為 200μM 時， Mg2+為 1.5mM 較合適。若樣品中含 EDTA 或其它螯合物，可適當增加 Mg2+的濃度。在高濃度 DNA 及 dNTP 條件下進行反應時，也必須相應調節(jié) Mg2+的濃度。一般 以 1.5-2mM（終濃度）較好。
2、dNTP ：高濃度 dNTP 易產生錯誤摻入，過高則可能不擴增；但濃度過低，將降低反應產物的產量。PCR 中常用終濃度為 50-400μM 的 dNTP。四種脫氧三磷酸核苷酸的濃度應相同，如果其中任何一種的濃度明顯不同于其它幾種時（偏高或偏低），就會誘發(fā)聚合酶的錯誤摻入作用，降低合成速度，過早終止延伸反應。此外，dNTP 能與 Mg2+結合，使游離的 Mg2+濃度降低。因此，dNTP 的濃度直接影響到反應中起重要作用的 Mg2+濃度。
3、Taq DNA 聚合酶酶：在 100μl 反應體系中，一般加入 2-4U 的酶量，足以達到每 min延伸 1000-4000 個核苷酸的摻入速度。酶量過多將導致產生非特異性產物。但是，不同的公司或不同批次的產品常有很大的差異，由于酶的濃度對 PCR 反應影響極大，因此應當作
預試驗或使用廠家推薦的濃度。當降低反應體積時（如 20μl 或 50μl），一般酶的用量仍不小于 2U，否則反應效率將降低。
4、 引物：引物是決定 PCR 結果的關鍵，引物設計在 PCR 反應中極為重要。