熒光定量PCR（Real-time PCR），是指在PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，通過對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測(cè),后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。反應(yīng)中對(duì)照的目的是對(duì)檢測(cè)的各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行監(jiān)控，因此我們按照檢測(cè)的流程對(duì)對(duì)照進(jìn)行梳理。沒有一種對(duì)照是wan美的，在檢測(cè)中我們要根據(jù)自己的需求來進(jìn)行靈活選擇和搭配。建議每一次檢測(cè)時(shí)添加一個(gè)能對(duì)從提取到擴(kuò)增環(huán)節(jié)進(jìn)行監(jiān)控的質(zhì)控品或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；每份檢測(cè)樣品中添加內(nèi)標(biāo)（如果樣品種類比較多樣建議使用人工內(nèi)標(biāo)，如果樣品類型為相對(duì)固定的動(dòng)物組織建議使用內(nèi)參基因）；擴(kuò)增陽性對(duì)照，擴(kuò)增陰性對(duì)照，無模板對(duì)照和ROX對(duì)照。有條件的添加臨床陽性對(duì)照和臨床陰性對(duì)照，在懷疑提取環(huán)節(jié)或者反轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題時(shí)使用核酸提取對(duì)照和反轉(zhuǎn)錄對(duì)照。不定期使用儀器空白對(duì)照。

一、陽性對(duì)照與污染

     不可否認(rèn)的一個(gè)事實(shí)是陽性對(duì)照可以增加實(shí)驗(yàn)室污染的風(fēng)險(xiǎn)。這種污染的來源一種是直接來源于擴(kuò)增陽性對(duì)照的污染。對(duì)于擴(kuò)增陽性對(duì)照來說通常10000拷貝/微升（CT值約25）是比較理想的，但是有一些試劑盒廠家的擴(kuò)增陽性對(duì)照設(shè)置在CT值20以下，比大部分陽性樣本都強(qiáng)。這么高濃度的對(duì)照給實(shí)驗(yàn)室?guī)砹司薮蟮奈廴撅L(fēng)險(xiǎn)，原因可能僅僅是因?yàn)樵噭S家擔(dān)心其陽性對(duì)照不穩(wěn)定，長(zhǎng)時(shí)間存放陽性對(duì)照降解。另一種污染來自于擴(kuò)增產(chǎn)物的處理不當(dāng)，或者實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計(jì)布局不合理。

二、初篩和確診

   對(duì)照與實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡年P(guān)系好像從來沒有人提及過。根據(jù)筆者多年在檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的經(jīng)驗(yàn)，分享一點(diǎn)個(gè)人的心得，歡迎大家批評(píng)指正。

對(duì)于初篩實(shí)驗(yàn)，我們希望提高真陽性檢出率，即提高診斷敏感性。我們需要檢測(cè)系統(tǒng)達(dá)到高檢測(cè)效率，因此要在不同環(huán)節(jié)添加陽性對(duì)照，確保每個(gè)環(huán)節(jié)的檢測(cè)效率高。

   對(duì)于確診實(shí)驗(yàn)，我們希望提高真陰性檢出率，即提高診斷特異性。我們需要確保檢測(cè)系統(tǒng)不出現(xiàn)假陽性，因此要在不同環(huán)節(jié)添加陰性對(duì)照，減少非必須的陽性對(duì)照，甚至要在樣品盤的不同位置中隨機(jī)插入幾個(gè)陰性對(duì)照，確保實(shí)驗(yàn)過程中沒有被污染。