免yi組化(immunocytochemistry)基本原理:抗體和抗原之間的結(jié)合具有高度的特異性，免yi組織化學(xué)正是利用了這一原理。先將組織或細(xì)胞中的某種化學(xué)物質(zhì)提取出來，以此作為抗原或半抗原，通過免yi動(dòng)物后獲得特異性的抗體，再以此抗體去探測組織或細(xì)胞中的同類的抗原物質(zhì)。由于抗原與抗體的復(fù)合物是無色的，因此還必須借助于組織化學(xué)的方法將抗原抗體結(jié)合的部位顯示出來，以其達(dá)到對組織或細(xì)胞中的未知抗原進(jìn)行定性，定位或定量的研究。

操作流程:

   1、脫蠟和水化

   脫蠟前，應(yīng)將組織芯片在室溫中放置60分鐘或60℃恒溫箱中烘烤20分鐘。

   1）組織芯片置于二甲苯中浸泡10分鐘，更換二甲苯后再浸泡10分鐘；

   2）無水乙醇中浸泡5分鐘；

   3）95%乙醇中浸泡5分鐘；

   4）70%乙醇中浸泡5分鐘；

   2、抗原修復(fù)

  用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片。

  1）抗原熱修復(fù)

  （1）高壓熱修復(fù) 在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）。蓋上不銹鋼高壓鍋的蓋子，但不進(jìn)行鎖定。將玻片置于金屬染色架上，緩慢加壓，使玻片在緩沖液中浸泡5分鐘，然后將蓋子鎖定，小閥門將會(huì)升起來。10分鐘后，去除熱源，置入涼水中，當(dāng)小閥門沉下去后打開蓋子。本方法適用于較難檢測或核抗原的抗原修復(fù)。

  （2）煮沸熱修復(fù) 電爐或者水浴鍋加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）至95℃左右，放入組織芯片加熱10~15分鐘。

  （3）微波熱修復(fù) 在微波爐里加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）至沸騰后將組織芯片放入，斷電，間隔5~10分鐘，反復(fù)1-2次。適用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。

  2）酶消化方法 常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前預(yù)熱至37℃，切片也預(yù)熱至37℃，消化時(shí)間約為5~30分鐘；胃蛋白酶消化37℃時(shí)間為30分鐘。適用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。

   3、免yi組織化學(xué)染色

   SP法

   1）脫蠟、水化；

   2）PBS洗2～3次各5分鐘；

   3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室溫靜置10分鐘；

   4）PBS洗2～3次各5分鐘；

   5）抗原修復(fù)；

   6）PBS洗2～3次各5分鐘；

   7）滴加正常山羊血清封閉液,室溫20分鐘。甩去多余液體。

   8）滴加Ⅰ抗50μl，室溫靜置1小時(shí)或者4℃過夜或者37℃1小時(shí)。

   9）4℃過夜后需在37℃復(fù)溫45分鐘。

   10）PBS洗3次各5分鐘；

   11）滴加Ⅱ抗40～50μl，室溫靜置，或37℃1小時(shí)；

   12）II抗中可加入0.05%的tween-20。

   13）PBS洗3次各5分鐘；

   14）DAB顯色5～10分鐘，在顯微鏡下掌握染色程度；

   15）PBS或自來水沖洗10分鐘；

   16）蘇木精復(fù)染2分鐘，鹽酸酒精分化；

   17）自來水沖洗10～15分鐘；

   18）脫水、透明、封片、鏡檢。

   SABC法

   1）脫蠟、水化。

   2）PBS洗兩次各5分鐘。

   3）用蒸餾水或PBS配置新鮮的3%H2O2，室溫封閉5～10分鐘，蒸餾水洗3次。

   4）抗原修復(fù)。

   5）PBS洗5分鐘。

   6）滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘。甩去多余液體。

   7）滴加Ⅰ抗,室溫1小時(shí)或者4℃過夜或者37℃1小時(shí)（4℃過夜后在37℃復(fù)溫45分鐘）。

   8）PBS洗三次每次2分鐘。

   9）滴加生物素化二抗,20℃～37℃20分鐘。

   10）PBC洗3次每次2分鐘。

   11）滴加試劑SABC，20℃～37℃20分鐘。

   12）PBS洗4次每次5分鐘。

   13）DAB顯色：DAB顯色試劑盒或者自配顯色劑顯色（鏡下掌握顯色程度）。

   14）蒸餾水洗。蘇木素復(fù)染2分鐘、鹽酸酒精分化。

   15）脫水、透明、封片、鏡檢。